生命学院马涵慧课题组与合作者开发出新型4D基因组成像工具

我校生命学院马涵慧教授课题组与麻省大学医学院Thoru Pederson教授合作开发了新型的活细胞 DNA标记系统“CRISPR-Sirius”。 北京时间2018年10月31日，相关成果以“CRISPR-Sirius: RNA scaffolds for signal amplification in genome imaging”为题，在知名学术期刊《自然-方法》（Nature Methods）上在线发表。CRISPR-Sirius极大地提高了在活细胞中跟踪DNA的灵敏度和多样性。为研究3D基因组动态结构如何在时间维度上变化（4D）、如何影响基因的转录和调控、如何决定细胞的命运奠定了很好的基础。

人类基因组含有约30亿个DNA碱基对，细胞里的基因组DNA大约为2米长，而细胞核的大小一般在10-20微米左右。染色体是如何高度折叠成3D结构并动态地调控基因表达一直是研究热点。染色体构象捕获（Hi-C，Dekker J et al., Science2002）和高通量DNA原位杂交（MERFISH, Wang S et al., Science2016）等技术正在被广泛地应用到3D基因组研究中，但这些技术主要应用在固定细胞中，解决的是静态的基因组3D结构。为了研究 4D（ 第4维度为时间）基因组动态结构和功能， CRISPR 技术被改造成用在活细胞中示踪序列特异的基因组DNA（Chen et al.,Cell2013），然而在单细胞中示踪不同的DNA元件以及DNA-DNA相互作用（比如增强子和启动子的动态变化等）仍然相当困难。

马涵慧教授早期利用CRIPSR Cas9的同源蛋白开发了活细胞DNA标记的三色系统，成功在单细胞中标记了多个染色体 （Ma H et al., PNAS2015）。2016年，他又进一步开发了CRISPRainbow技术（Ma H et al., Nat. Biotechnol. 2016），能够在活细胞里同时跟踪6个不同染色体。然而以上基于CRISPR的DNA标记系统由于不够灵敏，极大的限制了其在生物学研究中的应用。

马涵慧教授早期利用CRISPR-Broccoli系统发现CRISPR guide RNA在活细胞中的稳定性直接决定了CRISPR 标记或编辑的效率 （Ma H et al., J. Cell Biol. 2016）。在这项最新的研究中，马涵慧课题组再次利用CRISPR-Broccoli系统在活细胞中直接观察了不同位置的改造对guide RNA稳定性的影响（下图a & b），发现外源RNA插入到 tetraloop比3'-末端要稳定很多 。马涵慧课题组进一步和中佛罗里达大学的张少杰课题组合作，通过计算的方法寻找到了最稳定的RNA结构，成功地设计CRISPR-Sirius（下图c & d）。优化后的结构大大提高了基于CRISPR标记的灵敏度，可以用来同时标记一个染色体上多个位点。文章最后利用CRISPR-Sirius示踪同一条染色体上从几千个碱基（kbs）到几兆个碱基（Mbs）距离的不同位点，以人19号染色体为例子测量了染色体多个位点之间的空间距离以及它们在不同生理环境下的运动轨迹。这项新技术为基因组的4D结构和功能研究提供一个全新的平台。

本论文是由上海科技大学，美国麻省大学医学院和中佛罗里达大学共同完成，马涵慧教授为第一作者和唯一的通讯作者。

论文链接:https://www.nature.com/articles/s41592-018-0174-0

a. CRISPR-Broccoli系统的构建；b. 利用CRISPR-Broccoli活细胞检测CRISPR guideRNA的稳定性；

c.CRISPR-Sirius系统示意图；d.利用CRISPR-Sirius活细胞跟踪染色体高级结构。