物质学院季泉江课题组成功揭示新型Cas9核酸酶工作机理

近日，我校物质学院季泉江课题组与复旦大学甘建华课题组合作，通过晶体结构解析、细菌基因编辑以及体外DNA切割等手段,阐明了一种具有高保真和广PAM特性的新型Cas9蛋白——xCas9蛋白的化学工作机理。该研究成果以“Molecular basis for the PAM expansion and fidelity enhancement of an evolved Cas9 nuclease”为题，在知名学术期刊《科学公共图书馆•生物学》 （PLoSBiology）上在线发表。

CRISPR基因编辑技术自被发明以来，由于其高效性和简便性，已经被广泛应用于医学、生物学、化学、农学等领域的基础和应用研究。目前最为常用的CRISPR系统为酿脓链球菌中的Cas9蛋白系统。它主要由一种核酸内切酶SpCas9和一种介导RNA——sgRNA所构成。SpCas9核酸内切酶能够与sgRNA特异性结合，通过sgRNA与基因组PAM位点附近的DNA碱基互补配对，靶向识别基因组并实现基因组DNA的双链断裂。通过利用宿主细胞对双链DNA断裂的修复，研究人员能够方便快捷地实现靶向基因编辑。但是由于CRISPR/Cas9系统识别的PAM位点的有限性以及较高的脱靶性，其在医学和生物学等领域的深入应用受到了很大限制。

近期，科学家利用人工定向进化技术对SpCas9蛋白进行进化，开发了一种同时具有高保真和广PAM两大特性的新型Cas9核酸酶——xCas9，这也是目前人们开发出的唯一一种同时具有这两大优良特性的Cas9核酸酶。但这种进化获得的xCas9蛋白会同时具有高保真性和广PAM这两种特性的科学本质尚未被阐明。

在本项研究中，研究人员成功结晶并解析了xCas9蛋白与sgRNA以及带有不同PAM位点DNA的复合物晶体结构，揭示了xCas9蛋白采用一种独特的双结构识别模式。在识别经典的NGG的PAM位点时，xCas9蛋白与野生型的SpCas9蛋白具有相似的空间构象；而在识别非NGG的PAM位点时，xCas9蛋白中的α螺旋识别结构域与PAM位点识别区域发生了显著的空间结构变化。此外，研究人员还通过体外酶学活性实验与体内碱基编辑实验，揭示了xCas9核酸酶中引起高保真和广PAM特性的关键氨基酸位点。这些研究从分子层面揭示了xCas9蛋白同时具有高保真和广PAM两大优异特性的化学本质，为xCas9蛋白的应用研究提供了结构支持，同时也将为其它CRISPR系统效应核酸酶的定向进化和理性设计奠定基础。

本文第一、第二作者分别为季泉江课题组助理研究员陈未中博士和研究生张洪源，季泉江教授和复旦大学甘建华教授为共同通讯作者。上科大为第一完成单位。该研究得到了“生物大分子动态修饰与化学干预”重大研究计划培育项目、上海市科委青年科技启明星计划及上海光源等的大力支持。

文章链接：https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.3000496

图A：xCas9蛋白与sgRNA以及靶向DNA的复合物晶体结构。

图B:在识别不同PAM位点的DNA序列时，xCas9蛋白中的α螺旋识别结构域（REC结构域）会发生显著的空间结构变化。

图C：在识别不同PAM位点的DNA序列时，xCas9蛋白的PAM位点结合区域的氨基酸构象会发生显著变化。