生命学院孙博课题组解析SaCas9蛋白与靶向DNA互作的分子机制

北京时间8月13日，我校生命学院孙博课题组在知名学术期刊《EMBO Reports》上在线发表题为“Dynamics of Staphylococcus aureus Cas9 in DNA target association and dissociation”（金黄色酿脓葡萄球菌Cas9与目标DNA结合及解离的动力学）的研究论文。该论文首次揭示了金黄色酿脓葡萄球菌中的Cas9（Staphylococcus aureus Cas9，SaCas9）蛋白与靶标DNA结合、解旋、切割以及解离这一动态过程的分子机制以及两者之间的稳定互作位点。该工作对SaCas9作为DNA工具的开发和应用具有重要的指导意义。

CRISPR-Cas系统是存在于细菌及古菌中的一种适应性免疫防御系统，能够抵御外源核酸的入侵，维持基因的完整性和稳定性。该系统中的重要Cas蛋白识别间隔子相邻基序（protospacer adjacent motif, PAM），在指导RNA (guide RNA, gRNA）的引导下匹配目标DNA后对其进行切割。CRISPR-Cas系统的简单、灵活和高效使其作为一种新的基因组工具在各种生物体中有着广泛应用。而作为一项新技术，CRISPR-Cas系统的应用同样也存在一些亟待解决的问题，如Cas蛋白存在脱靶效应，非靶向切割可能发生在对生物功能有重要影响的基因组位置，从而破坏细胞的基本功能。这给该系统的应用带来了极大风险。而深入了解Cas蛋白的工作机制，对提高其作为DNA工具的效率和准确率将会有巨大帮助。

SaCas9是目前自然界中发现的II型CRISPR-Cas系统中体积较为小巧的Cas9蛋白，由1053个氨基酸组成。因此，该蛋白便于体内递送，可在多种生物中进行基因组编辑。该研究使用一系列的单分子方法系统地研究了SaCas9与靶向DNA互作的动力学机制（图1A）。研究发现，SaCas9结合和切割靶向DNA分别需要6bp和18bp的PAM近端DNA与gRNA互补。这些酶活性是由DNA蛋白间两个稳定的互作位点介导的，其中之一位于距PAM约6bp处，另一个在原始间隔区域内（图1B）。有趣的是，SaCas9在切割DNA后会自动释放PAM远端DNA，同时保持与PAM的结合（图1B）。该部分DNA的释放同时消除了SaCas9与原始间隔子DNA的强相互作用，有益于其随后从PAM端的最终解离。

这项工作为进一步优化SaCas9活性、减少脱靶提供了重要的分子基础，并且为设计gRNA以改进其特异性和开发更高效率的SaCas9衍生物提供了新思路。

该论文中，孙博教授课题组2018级博士研究生张思奇和2020届博士生张倩（已毕业）为共同第一作者，孙博教授为本文唯一通讯作者，上科大为第一完成单位。该研究工作得到了科技部、上海市科委以及上科大科研启动基金的支持。

文章链接：https://www.embopress.org/doi/10.15252/embr.202050184

图1: (A) 单分子荧光光镊技术观测SaCas9切割DNA后释放部分DNA；(B) SaCas9结合、解旋、切割以及释放靶向DNA的动态过程示意图。