生命学院孙博课题组与合作者揭示Cas9蛋白高效靶向DNA的分子机制

近日，上科大生命学院孙博课题组与南京医科大学沈彬课题组合作在知名学术期刊《核酸研究》（Nucleic Acids Research）在线发表题为”Efficient DNA interrogation of SpCas9 governed by its electrostatic interaction with DNA beyond the PAM and protospacer“（ SpCas9与PAM和protospacer外的DNA静电互作决定其高效定位靶向DNA）的研究论文。该论文明确SpCas9位于1151-1156中的四个赖氨酸通过静电力与PAM和protospacer外的DNA互作，并揭示了该位点在调控SpCas9靶向DNA中的功能及机制。

CRISPR/Cas系统是一种广泛存在于细菌和古菌中的获得性免疫系统，可防御外源基因（如病毒和质粒等）的入侵。其中，II类CRISPR/Cas系统中来源于酿脓链球菌的Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）目前被研究和使用的最为广泛。但是SpCas9蛋白存在脱靶效应，随之带来的随机性基因突变有着诸多风险。因此，深入了解SpCas9蛋白工作的分子机制，对提高编辑效率和准确性有重要指导意义。

此前，孙博课题组与合作者利用单分子光镊技术在SpCas9的20个碱基对识别区以外PAM下游发现一个意料之外的DNA结合位点，即后PAM互作位点。重要的是，该位点的缺失严重影响SpCas9对靶向DNA的结合及切割活性。但该位点的本质及其调控SpCas9的分子机制尚不清楚。本论文通过光镊、荧光共振能量转移等单分子实验，结合凝胶电泳及体内DNA酶切等实验对四种SpCas9的突变体进行了靶向DNA酶切过程的逐步检测及对比。

研究发现，SpCas9的PI结构域中1151-1156区域内的四个赖氨酸与后PAM的带负电DNA磷酸骨架之间存在静电作用，通过改变该区域氨基酸的带电性可以对SpCas9的蛋白活性进行定向调控。此外，后PAM互作位点在功能上主要支配SpCas9的快速靶向DNA采样过程并参与到protospacer的解旋及R-loop的形成。基于以上研究，作者提出了分子机制模型明确后PAM互作位点对SpCas9的调控过程（图）。该工作不仅揭示了SpCas9如何在众多基因中快速定位靶向DNA，同时也为提高其作为基因编辑工具的效率和准确率提供了关键的理论基础和开发方向。

该论文中，孙博教授课题组2017级博士生张倩（已毕业）及2020级博士生陈紫婷为共同第一作者，孙博教授和沈彬教授为共同通讯作者，上海科技大学为第一完成单位。参与该工作的还有上海科技大学生命学院黄行许教授。上科大分子细胞平台的工作人员对该项研究提供了技术帮助。该工作得到了科技部、国自然基金委、上海市科委以及上科大启动基金的支持。

文章链接：https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkab1139/6439681#