近日，上海科技大学物质科学与技术学院刘一凡课题组与浙江大学团队合作，基于单片集成的氧化锌纳米棒修饰的高密度微腔室阵列芯片，开发出一种荧光增强数字聚合酶链式反应(PCR)技术，可用于在单分子水平对DNA进行快速和高灵敏度的绝对定量，该技术有望用于病原体快速检测、癌症早筛等生物医学领域。合作成果发表于生物传感领域期刊Biosensors and Bioelectronics。
图1：（A）荧光增强数字PCR芯片分解示意图，（B）将微通道板（MCP）分割为4 × 4 mm2大小的区域，每个区域包含2.5 × 104个微孔，（C）荧光增强数字PCR芯片示意图的俯视图和横截面图。II：（A）扫描电子显微镜下微通道板（MCP）截面斜视图，（B）扫描电子显微镜下微通道板（MCP）截面的表面特写，（C）通过局部斜角沉积（LOAD）将ZnO纳米棒均匀地积淀在微通道板侧壁，（D）ZnO纳米棒功能化的微通道板上微孔的扫描电子显微图，（E）II（D）的局部结构放大图。
核酸检测对感染性疾病、肿瘤和出生缺陷等疾病的早期和快速诊断至关重要。自1985年美国科学家Kary Mullis开发出第一代以PCR技术为基础的核酸定性分析方法后，通过不断改进，第二代实时荧光定量PCR技术、第三代核酸检测技术的数字PCR（dPCR）技术逐渐实现了由定性分析到定量测定的技术进步。dPCR将连续的液相反应体系分割于数万至数百万独立的皮升级微腔室中进行离散扩增，使该技术具备单分子级别的高灵敏度和绝对定量的优势。然而，dPCR技术仍存在需要热循环，反应周期较长，经济和时间成本较高，动态范围较窄等缺点。
为增强dPCR临场快速核酸检测能力，刘一凡组与浙江大学研究团队合作开发出了一种基于ZnO纳米棒修饰的微通道板（MCP）集成dPCR微芯片（图1）。MCP是一种高度多孔的玻璃薄膜，通常用于实现检测中的粒子倍增。研究团队将MCP巧妙地集成在微流体芯片中，为PCR反应体系提供海量独立的微腔室。高度透气的微流体芯片作为“气泵”，使得样品的加载和微腔室化可由简单的移液步骤实现，无需额外设备。
为减少热循环周期、缩短检测时间，研究团队利用纳米加工手段，将ZnO纳米棒均匀地积淀在微通道板侧壁。由于纳米棒的表面等离子效应，PCR产物的荧光强度得到了极大增强，DNA扩增终点检测的时间从小时级缩短到25分钟，同时提高了检测精度。此外，该系统的微腔室密度高达1563 mm-2，在指甲盖大小的面积内即可形成超过15万个独立微腔室，这大大提升了dPCR的可扩展性，使得百万级微腔室扩增成为可能。
利用该集成系统，研究人员对噬菌体λDNA和癌症相关PLAU基因进行快速的单分子级别绝对定量。在定量过程中，样本中的目标核酸分子被随机分散在数以万计的独立微腔室中进行扩增。每个微腔室内仅需单个核酸分子即可实现有效扩增，从而被后续的荧光成像和自动化图像分析算法精准识别（图2）。经过反复试验，该技术在核酸绝对定量中的总体测量偏差小于5%。基于上述优势，该新型集成化微系统有望加速数字PCR技术在病原体快速检测、癌症早筛等生物医学领域的广泛应用。
图2：从原始图像中识别阳性微孔的数据采集过程，（A）采集热循环后数字PCR芯片原始实验图像，（B）选取目标区域，（C）定位和计数所选微孔，（D）二值化算法去除阴性微孔并增强对比度，（E）标定阳性微孔。II：使用荧光增强数字PCR芯片对噬菌体λDNA进行五步连续稀释并对其进行荧光定量；III：（A）使用荧光增强数字PCR芯片对PLAU基因进行连续稀释并对其进行荧光定量，（B）绘制阳性微孔比例与稀释系数之间的线性回归曲线，（C）荧光增强数字PCR芯片对PLAU基因的定量可与商用的Nanodrop、qRT-PCR相媲美。
本项研究题为“Monolithically integrated microchannel plate functionalized with ZnO nanorods for fluorescence-enhanced digital polymerase chain reaction”，由上海科技大学与浙江大学和合作完成。浙江大学信息与电子工程学院副教授曹臻为论文的第一作者，上海科技大学物质学院刘一凡教授和浙江大学信息与电子工程学院董树荣教授为共同通讯作者，物质学院助理研究员张蓉为论文的共同作者。
论文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2022.114499
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