近日，上海科技大学物质科学与技术学院刘一凡课题组与合作者成功开发新型荧光编码超宽动态范围数字PCR技术，相关研究成果发表于国际知名学术期刊Biosensors and Bioelectronics。
数字PCR（dPCR, digital polymerase chain reaction）技术由于其绝对定量能力和极高灵敏度被广泛应用于分子诊断领域。美中不足的是，与目前的金标准定量PCR （qPCR）相比，dPCR在动态范围上落后了3-4个数量级，极大限制了其在临床领域的应用。如在对一些载量范围波动较大的病毒感染样本进行定量分析时，高载量的样本往往会使dPCR显全阳性而无法通过泊松分布定量。
针对上述问题，刘一凡教授团队与中国科学院上海微系统所、南方医科大学南方医院团队合作开发了荧光编码对数稀释数字PCR技术（Flodd-PCR）。作为一种新颖的超高动态范围的数字PCR技术，Flodd-PCR巧妙运用微流控技术和荧光编解码策略，实现了多种浓度样本检测的“多路复用”。该技术展示出的动态范围为107，比传统dPCR高了逾两个量级，在操作流程上与传统数字PCR高度一致，可兼容商业化数字PCR设备，在实际应用推广中具有重要优势。
Flodd-PCR方法的基本原理（图1）是在一次dPCR反应中引入四种对数稀释的样本浓度，每种稀释倍数分别对应一种浓度指示剂荧光强度；PCR后，液滴根据荧光强度分成四组，每组分别进行拷贝数定量。因此一次Flodd-PCR实验约等效于四组梯度稀释的、平行的dPCR实验，检测动态范围大幅提高。
图1：Flodd-PCR原理流程图
凭借连续梯度稀释的功能，Flood-PCR技术能够将检测动态范围扩宽到4-20,000,000拷贝/µL（图2）。为了验证临床检测上的实用性，研究团队将其应用于临床患者样本中人乳头状瘤病毒HPV(16型)的定量检测。实验结果表明（图3），得益于更高的动态范围，Flodd-PCR的定量成功率优于dPCR，其定量结果也和金标准qPCR高度一致，表明Flood-PCR技术可为临床医学提供新型高效精准的检测能力。
图2：Flodd-PCR的动态范围标准
图3：Flodd-PCR对临床HPV样本的高动态范围定量
刘一凡课题组2023届硕士毕业生施清源、2021级博士研究生李婕、南方医科大学南方医院检验科刘春辰博士为本文共同第一作者，上海科技大学刘一凡教授、中国科学院微系统研究所罗源副研究员、南方医科大学南方医院郑磊教授为本文通讯作者。
论文题目：Fluorescence-coded logarithmic-dilution digital droplet PCR for ultrawide-dynamic-range nucleic acid quantification
沪公网安备 31011502006855号