果蝇（Drosophila melanogaster）作为重要模式生物之一，为基因功能研究、发育生物学、疾病模型构建和药物开发提供了不可或缺的研究平台。过去近20年间，依赖PhiC31整合酶的外源基因定点整合技术凭借更高的精确性，逐渐成为全球约3000个果蝇实验室广泛使用的金标准。然而，PhiC31技术的局限性也日益显现，如整合效率低、对基因大片段整合能力有限以及实验操作繁琐等，不仅增加了实验成本和研究周期，还限制了研究效率。在面对全基因组规模化筛选和高通量研究的需求背景下，开发更高效、更便捷的技术成为该领域的关键突破方向。
近日，上海科技大学生命科学与技术学院高冠军课题组在《核酸研究》（Nucleic Acids Research, NAR）期刊在线发表了题为“A powerful and highly efficient PAI-mediated transgenesis approach in Drosophila” 的研究论文。研究团队成功开发出一种基于铜绿假单胞菌整合酶（Pseudomonas aeruginosa Integrase, PAI）的新型高效果蝇转基因系统。研究显示，该系统的转基因效率可达到PhiC31技术的近10倍，并成功克服了传统方法整合效率低、基因大片段整合能力受限等方面的核心瓶颈。这一技术突破为果蝇遗传学研究提供了更高效的工具。
通过对百万级微生物基因组的系统性生物信息学分析和实验筛选验证，团队成功开发了一种基于PAI新型整合酶介导的高效转基因系统。结果显示，PAI系统在约 10 kb 基因大片段定点整合实验中的转基因成功率高达62%，较传统 PhiC31系统效率提升近10倍（一个数量级）。更重要的是，PAI系统能够高效整合高达32 kb的外源基因大片段，而 PhiC31系统在整合15 kb以上片段时效率显著下降甚至完全失败。该突破为复杂基因组研究及超大基因片段的精准整合提供了全新可能。
PAI整合酶的鉴定及PAI介导的高效转基因技术
为进一步提升PAI系统的应用灵活性，团队还开发了覆盖果蝇三大染色体的多个靶位点菌株，包括常用的PAI-attP40（第2染色体）和PAI-attP2（第3染色体）。实验验证显示，这些靶位点在15 kb基因大片段整合实验中效率卓越，与传统PhiC31系统相比，PAI系统在整合效率方面优势明显。这不仅为研究者提供了更多选择，还显著简化了实验流程，为高通量研究提供了强有力的技术保障。此外，PAI系统还展现出与前沿基因编辑技术的良好兼容性，它可无缝结合CRISPR等基因编辑工具，用于精准操控基因调控网络。因此在器官发育调控及疾病模型构建等领域，该系统有着强大的应用潜力。
总之，PAI系统的开发不仅极大提高了果蝇转基因的效率，还为基因超大片段的精准整合提供了前所未有的技术方案。这一突破将加速遗传学研究进程，在功能基因组学、疾病模型构建和高通量筛选等领域具有深远意义。为推动该前沿技术的普及，研究团队免费开放PAI-attP 工具果蝇供全球学术研究使用。
高冠军课题组硕士研究生史王飞、原副研究员张雪迪与博士研究生孙昂扬为本论文共同第一作者。高冠军和张雪迪为本文共同通讯作者。上海科技大学是该工作第一完成单位。
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