近日，上海科技大学生命学院孙博课题组、孙亚东课题组联合上海交通大学生命学院冯雁课题组在细菌免疫机制研究领域取得重要进展。通过单分子操纵、共聚焦成像、结构预测与生物化学等实验手段，系统解析了细菌防御系统DdmDE识别并清除外源质粒的动力学分子机制。相关成果以“The DdmDE defense system eradicates plasmids by target-centered bidirectional ssDNA loop extrusion and site-specific cleavage”为题，在国际学术期刊《分子细胞》（Molecular Cell）上发表。
细菌免疫系统通过识别并清除外源遗传元件，在调控水平基因转移（Horizontal Gene Transfer, HGT）及限制抗生素耐药基因传播的持续博弈中发挥核心作用。作为细菌免疫系统的重要组成部分，原核Argonaute（pAgo）系统近年来已成为生命科学领域研究热点。与CRISPR-Cas相比，基于pAgo的防御系统展现出更为灵活的生化特性。首先，pAgo系统通常无需PAM序列，能够实现对任意序列的精准识别，拓宽了靶向范围；其次，不同于CRISPR仅依赖RNA引导，pAgo可以利用短链DNA/RNA作为引导，并在高温或常温下直接靶向单链或双链DNA/RNA，这种多功能的核酸判别能力使其在分子诊断和基因操作中具有天然优势。
2022年，科学家在霍乱弧菌中发现了一种新型的pAgo防御系统DdmDE。随后，多个团队报道了该系统利用独特的DdmE和DdmD双蛋白协同工作，实现短入侵质粒的清除。其中，DdmE作为一个无核酸酶活性的pAgo蛋白，利用guide DNA（gDNA）识别外源DNA；而DdmD具有解旋酶与核酸酶活性，被招募后实施具体的dsDNA解旋和切割工作。DdmE如何精准识别出外源质粒？两个蛋白如何实现高效协同？DdmD如何协调解旋酶和核酸酶活性？这些动态过程背后的分子动力学原理，正是理解细菌免疫防御多样性、乃至开发新型生物技术工具所亟待攻克的核心科学问题。
本研究结合荧光共聚焦与光镊技术，在单分子水平实现了对DdmDE识别并处理DNA过程的实时动态分析。研究发现，DdmE能够敏锐发现并结合dsDNA力学张力（mechanical tension）诱导产生的气泡结构（DNA bubble）；不同于CRISPR-Cas9系统通过降低能垒稳定R-loop结构，DdmE-gDNA通过调控在DNA气泡结构上的解离速率来区分靶点与非靶点；锁定靶点后，DdmE便充当支架快速招募二聚化的DdmD；随后DdmD以DdmE为中心，对抗高达数十皮牛的dsDNA负载，以ssDNA环挤出（loop extrusion）的方式双向解旋dsDNA；最后，游离的DdmD蛋白快速结合新生成的ssDNA，并实现针对5'-G位点的序列特异性切割（图）。
图：细菌DdmDE防御系统清除外源质粒的分子机制模型。DdmE-gDNA捕捉力学张力诱导的瞬时DNA气泡，通过动力学差异识别外源质粒靶点。DdmE招募DdmD二聚体，启动双向dsDNA解旋与ssDNA环挤出。暴露出的ssDNA被游离DdmD分子结合，通过5'-G特异性的延迟切割实现质粒清除。
该工作系统解析了DdmDE系统清除外源质粒的分子动力学机制，发现了一种独特DNA解旋模式，揭示了力学信号在细菌免疫识别中的重要作用，阐明了由分子马达高效执行的机械化学偶联防御机制，为深入理解细菌免疫多样性及开发新型生物技术工具提供了重要理论支撑。
上海交通大学博士生杨昊及上海科技大学博士生宋晓萱、赵家铮为该论文的共同第一作者，孙博教授、冯雁教授及孙亚东教授为共同通讯作者。
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